ELISA检测过程中的常见问题及解决方案
请用微信扫一扫
ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assays，ELISA) 即酶联免疫吸附实验，是目前广泛应用于各种抗原抗体检测的方法，主要有灵敏度高和特异性强的特点。ELISA操作步骤看似简单，整个测定过程中却有诸多影响因素，导致检测结果可能与实际结果偏差较大。最常出现的问题包括显色淡，灵敏度偏低、重复性不佳等。
为帮助大家分析实验中常见问题，我们将ELISA实验中常见问题和解决方案归纳总结如下，供临床检测中参考。
常见问题1：显色淡，灵敏度偏低，阳性对照值偏低
| 序号 | 可能原因 | 解决方案 |
|---|---|---|
| 1 | 试剂盒未平衡至室温 | 实验前试剂盒应置于室温平衡至少30分钟，以确保所有试剂均已平衡至室温 |
| 2 | 温育温度不足37℃ | 应注意培养箱温度，放入反应板后尽量减少开启次数以免影响温度恒定 |
| 3 | 温育时间不够 | 校正定时钟准确定时 |
| 4 | 样品或酶结合物加样量偏少 | 校准移液器；注意使枪头与移液器接合紧密，移液时不宜过快，排放完全 |
| 5 | 洗涤时冲击力太大、浸泡时间过长、洗涤次数增加，底物作用时间不够 | 严格按照说明书操作 |
| 6 | 样品用NaN3防腐剂，抑制了酶的活性 | 与酶一同加入的样品中不能用NaN3防腐 |
| 7 | 蒸馏水被污染、水质有问题 | 使用新鲜合格的蒸馏水 |
| 8 | 洗液配制不当 | 准确稀释浓缩洗涤液 |
| 9 | 试剂盒在运输途中时间太长 | 夏天长途运输时应放足够冰袋并尽可能缩短运输时间 |
| 10 | 试剂盒超过有效期 | 过期试剂不可以使用 |
| 11 | 不同批号试剂混用 | 不同批号试剂不能混用 |
常见问题2：高背景，阴性对照值偏高，假阳性
| 序号 | 可能原因 | 解决方案 |
|---|---|---|
| 1 | 阴性对照被阳性对照或样品污染 | 洗涤时勿将洗液溢出孔外 |
| 2 | 温育时间过长，导致非特异性结合 | 校正定时钟准确定时 |
| 3 | 加样量过多 | 严格按照说明书操作，加液量、稀释要准确 |
| 4 | 温育温度过高 | 应注意培养箱温度是否正确、恒定 |
| 5 | 加显色剂后在温育时受强光或紫外线照射 | 应保存在暗处，避光 |
| 6 | 读板前停留时间过长 | 加终止液后10分钟内测定结果 |
常见问题3：重复性差，两个复孔值相差太大
| 序号 | 可能原因 | 解决方案 |
| 1 | 样品数量多少不一，加样时间有长有短 | 重复某一样品时，加样时间尽可能与第一次接近 |
| 2 | 保温时间不一致，洗涤条件不一致，操作人员不一致 | 重复测定标本，操作条件、人员等应尽可能与上次保持一致，以排除这些因素造成的不一致的可能性 |
| 3 | 加样量不一致 | 样品稀释前应充分混匀，尽可能使用同一移液器并装紧吸嘴 |
| 4 | 不同批号试剂盒组分混用 | 不同批号试剂不能混用 |
常见问题4：满板白，阳性对照不显色
| 序号 | 可能原因 | 解决方案 |
| 1 | 把终止液误当作酶结合物或底物使用 | 严格按说明书操作，加液时看准标签，换用合格的蒸馏水或去离子水，选用洁净量筒，正确稀释洗涤液，不要漏加试剂 |
| 2 | 漏加或错加试剂，如酶结合物、底物A、B液 | |
| 3 | 蒸馏水、配制洗涤液的量筒或盛洗涤液的瓶子受酶抑制物污染 |
常见问题5：满板显色
| 序号 | 可能原因 | 解决方案 |
|---|---|---|
| 1 | 读板前停留时间过长 | 加终止液后10分钟内测定结果 |
| 2 | 加显色剂后在温育时受强光或紫外线照射 | 应保存在暗处，避光 |
| 3 | 温育时间过长，导致非特异性结合 | 校正定时钟准确定时 |
| 4 | 温育温度过高 | 应注意培养箱温度是否正确、恒定 |
| 5 | 加样量过多 | 严格按照说明书操作，加液量、稀释要准确 |
| 6 | 样品放置时间过长，样品染菌 | 样品可长期保存于-20℃，防止污染 |
| 7 | 洗涤不充分，反应孔中有酶残留 | 应充分洗涤 |
| 8 | 蒸馏水被污染 | 使用新鲜合格的蒸馏水 |
| 9 | 温育时未贴封板膜，使样品或酶标试剂蒸发，吸附于孔壁难以清洗 | 温育时应贴封板膜或加盖 |
优质的试剂，良好的仪器和正确的操作是保证ELISA检测结果准确可靠的必要条件。一些细节操作不当就会对试验结果造成很大偏差，因此我们在实验中应注意以下事项：
1. 加样：
不规范的移液操作可能带来0.1％到5％的移液误差，甚至更高！
（1）移液器定期校准：选择密封性好质量可靠的吸头，吸量不准确，直接影响检测结果；
（2）加样前，溶液充分混匀，垂直悬空加入液体，避免加在孔壁上或产生气泡；
（3）加样时避免液体溅出，如有样本溅出，应用吸水纸轻轻拭干，并做相应记录；
（4）如果移液器漏气致使加样量不足，可先吸出（尽量吸净）后加入需求量，并做好相应记录，若结果在灰区，需要复核检测；
（5）每次加样顺序一致，尤其底物、终止液顺序一致，保证每个孔显色时间相同。
2. 试剂盒使用前室温平衡：
温度是ELISA结合反应的重要影响因素，为使所有样本在一致的温度下反应，实验前务必将所有的试剂平衡至室温，包括检测样本，避免因温度的动力学反应差异而导致ELISA检测结果的不准确。
3. 标准品的溶解与稀释，严格按说明书要求进行。
ELISA标准曲线是结果计算的尺子，标准品是ELISA实验成功与否的关键点。
（1）标准品短暂离心，让因运输沾到管盖、管壁的标准品沉到管底。
（2）根据说明书加入一定体积的蒸馏水（或说明书指定溶液），加水后轻柔涡旋震荡，室温静置混匀。
4. 标准品和样本做复孔
为了获得更准确的实验结果，标准品和样本进行复孔检测。
（1）计算平均值，确保实验结果更准确。
（2）解决实验中失误操作造成的跳孔现象。
（3）计算CV值，对实验的操作和试剂盒的精密度进行评估。
5. 温育
(1) 温育时，反应板均不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡。应注意温育的温度和时间应按规定力求准确。
(2) 根据说明书进行温育，并注意避光需求。在进行室温反应时，若环境温度与规定条件偏差较大，可使用恒温培养箱进行有效温育。
6. 洗涤
（1）手工洗板，拍板时要垂直，避免交叉污染，用力不能过猛致使液体返溅；
（2）机器洗板应经常检查冲洗头是否畅通，若被异物堵塞可用纤细针头挑出。并注意维护保养，每天使用后用纯化水或去离子水冲洗管路，保持管路洁净。
（3）洗涤后反应板尽量扣干；扣干使用的吸水材料应为无尘材质，避免污染反应孔；扣干后的反应板立即加液，不能干板太久影响反应。
7. 检测
（1）酶标仪使用前务必预热10~15分钟，使结果更稳定。
（2）长时间高湿度容易损坏酶标仪滤光片，长时间不用酶标仪时，需要定期开机维护，以保证设备性能正常。酶标仪每年均需定期校验，保证测定结果准确。
（3）根据说明书要求在规定波长条件下使用酶标仪进行结果读取。有些说明书规定双波长测定，该方法可以最大限度的消除指纹、杂质及不透光的物质对酶标仪读数带来的误差，以保证实验数据的准确度。
（4）TMB是ELISA检测中常用的底物，经HRP作用后显蓝色，经酸终止后，TMB产物由蓝色呈黄色，可在比色计中定量，最适吸收波长为450nm。
